Εργαστηριακές τεχνικές

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

  Η μέτρηση των Αμινοξέων, της ελέυθερης και των ακυλιομένων καρνιτινών περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια

  • Εκχύλιση αποξηραμένων σταγόνων αίματος των νεογνών με διάλυμα που περιλαμβάνει σταθερά ισοτοπικά εσωτερικά πρότυπα.
  • Ανάλυση με την χρήση Φασματομετρίας  Μάζας Tandem MS

Η  λειτουργία του φασματομέτρου Μάζας περιλαμβάνει

  1. Την παραγωγή ιόντων από τους μεταβολίτες του υπό ανάλυση δείγματος.
  2. Την επλογή προδρόμων (Precursor) ιόντων σύμφωνα με την μάζα τους στον πρώτο φασματόμετρο (analyzer) του συστήματος.
  3. Την διάσπαση των επιλεγμένων προδρόμων ιόντων με την βοήθεια αερίου Αργού, και την δημιουργία παραγώγων ιόντων.
  4. Την ανάλυση των παραγώγων ιόντων σύμφωνα με την μάζα τους στο δεύτερο φασματόμετρο  του συστήματος

Η τεχνική αυτή είναι εξαιρετικά ακριβής στην ανίχνευση συγκεκριμένων ενώσεων που βρίσκονται σε πολύπλοκα μείγματα όπως το αίμα του νεογνού. Ο ιονισμός των μεταβολιτων πραγματοποιείται με την μέθοδο Electrospray, μία  τεχνική ήπιου ιονισμού που επιτρέπει την φασματομετρική ανάλυση labile πολικών ενώσεων όπως αυτές που ανιχνεύονται στην διερεύνη ση μεταβολικών νοσημάτων. Επίσης  στην μέθοδο αυτή ιονισμού, η απόκριση του λαμβανόμενου σήματος εξαρτάται από την συγκέντρωση και αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται  για την ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών που ευρίσκονται στο υπό ανάλυση διάλυμα.

Οι Καρνιτίνες αναλύονται με αυξημένη ευαισθησία μετα από εστεροποίηση και σχηματισμό βουτυλεστέρων. Η ανάλυση πραγματοποιείται με ανίχνευση των προδρόμων (parent) ενώσεων σε εύρος m/z : 200-500, που δίνουν ένα κοινό fragment με μάζα 85 Da. Με τον τρόπο αυτό ανιχνεύονται όλες οι βουτυλιομένες ακετυλκαρνιτίνες και η ελεύθερη καρνιτίνη, πού υπάρχουν στο δείγμα.

Η ανάλυση των αμινοξέων πραγματοποιείται επίσης με βουτυλίωση της καρβοξυλομάδας που περιέχουν.Για την ανίχνευση των περισσότερων  από τα Αμινοξέα που διερευνώνται, η Φασματογραφική ανάλυση που πραγματοποιείται είναι τύπου σταθερής απώλειας ουδέτερης μάζας (constant neutral loss σε m/z : 102) στην οποία ο πρώτος αναλυτής μάζας (MS1) σαρώνει ένα συγκεκριμένο εύρος μαζών (m/z 140- 270) και ο δεύτερος αναλυτής μαζών (MS2) σαρώνει το ίδιο εύρος μαζών με σταθερή διαφορά μάζας από τον αναλυτή MS1.

Για ορισμένα από τα διερευνούμενα αμινοξέα (Γλυκίνη, Ορνιθίνη, Κιτρουλλίνη, Αργινοηλεκτρικό  οξύ (ASA), Αργινίνη), για την αύξηση της ευαισθησίας προσδιορισμού τους  χρησιμοποιείται μία Τρίτη μέθοδος ανίχνευσης: Multiple Reaction Monitoring (MRM) στην οποία προσδιορίζονται συγκεκριμένες μεταπτώσεις  (transitions) ιόντων αρχικών και τελικών .